近年來，隨著對蛋白酶K研究的深入，該酶的應用范圍不僅在醫療診斷及科研領域得到了十分廣泛的應用，該酶還作為替代其它作用范圍較窄的蛋白酶，主要應用于造紙、工業制革、飼料生產、食品加工等行業中。此外，該酶還可以替代傳統的通過化學方法處理原材料的方法，減少污染。
  在各行各業中，蛋白酶K的主要用途有：
①在分離DNA和RNA的過程中，用于核酸酶的蛋白水解失活。
蛋白酶K能降解與核酸結合的蛋白質，促進蛋白與核酸的分離，因此該酶在提取高分子量的核酸時具有很大的優勢。蛋白酶K還常被用于RNA提取過程中抑制和降解RNase，防止提取的RNA被降解。RNA的質量對于cDNA合成、Northem印跡及雜交分析及體外翻譯等實驗的成敗至關重要。但是RNA極不穩定、易于被環境中廣泛存在的RNase降解，而利用蛋白酶K可創造一個不含RNase的環境、以防止在提取RNA時被RNase污染，因此該酶的使用是成功提取RNA的關鍵。在核酸提取實驗中蛋白酶K的工作濃度大約是0.05-0.2mg/mL，一般情況下，提取一個樣本的核酸大約需要0.1mg的蛋白酶K ，而在實際使用過程中，為了增加核酸提取效率，通常會將蛋白酶K進行加量使用。核酸檢測量劇增，造成對蛋白酶K需求激增，蛋白酶K原有的供需平衡被迅速打破，導致蛋白酶K一夜之間成為了緊缺的防疫物資。
②在生活和工業用水中滅活病毒。
病毒外層結構一般以衣殼蛋白為主，因此蛋白酶K可以對病毒表面的蛋白進行破壞，進而造成病毒因結構不完整不再具有攻擊宿主細胞的能力。有研究結構表明，在蛋白酶K濃度為67.51ug/mL條件下對純水和生活污水中病毒處理lh，其對病毒的滅活率分別達到了99.4％和49.4％，而處理3h時，其病毒滅活率分別為>99.9％和81.8％。用含蛋白酶K的消毒劑對病毒滅活的優點是消毒劑為蛋白質，無污染，不產生有害消毒產物，是一種高效且環保的消毒方法。
③在肉類嫩化中的應用
蛋白酶K能分解肉中肌纖維與結締組織的蛋白質，甚至可以分解彈性蛋白及膠原蛋白，使肉類的各組織結構發生改變，如肉中部分肽鍵斷裂，吸水膨脹，質地變嫩，增強肉的口感。
④在其它生物行業中的應用，主要包括：
1）用于去除內毒素結合的陽離子蛋白，如溶菌酶和核糖核酸酶A。
2）可用于分離肝、酵母和綠豆線粒體
3）用于測定酶在細胞膜上的定位
4）用于石蠟包埋組織切片的處理，暴露用于抗體標記的抗原結合位點。
5）用于可傳播海綿狀腦病(TSE)研究中朊病毒腦組織樣本蛋白的消化。
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