熒光蛋白Marker優化方案

    有報道稱一種自預染熒光蛋白Marker，能夠實現蛋白Marker即是預染蛋白又是曝光蛋白。  具體原理是：將天然提取的熒光蛋白（包括藻紅蛋白、藻藍蛋白、別 藻藍蛋白、綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白和紅色熒光蛋白等，其分子量為 20-300kDa），與能夠結合抗體IgG的proteinA、proteinG和能被二抗結合的抗體Fc區蛋白或肽共價偶聯，由于熒光蛋白自帶顏色，從而實現蛋白即是預染蛋白，又是熒光蛋白的目的，無需轉膜染色或X光片成像，此外，熒光蛋白Marker條帶可特異性結合一抗或者二抗，使蛋白樣品和蛋白marker 經化學發光檢測后，能夠同時在X光片上顯示出來。
     此方法的優點克服了預染蛋白Marker的化學修飾（染料屬于有機化合物），只是將不同功能的蛋白或多肽偶聯在一起（類似于融合蛋白），不會出現電泳遷移變化，蛋白分子量不準確的現象；也不會影響和膜的結合能力，能夠很好的提示轉膜情況；還能實現蛋白Marker與目標蛋白顯示在同一張照片上。缺點是需要將天然提取的熒光蛋白經過復雜的化學反應偶聯上識別抗體的蛋白或多肽才能實現共同曝光在一張照片上，此過程操作復雜繁瑣，還會造成批間差異。

熒光蛋白Marker優化方案
   方案一：利用色素蛋白Marker代替預染Marker，此類蛋白包括含鐵卟啉的色素蛋白質、含黃素的色素蛋白質和含胡蘿卜素的色素蛋白質等。由于蛋白沒有進行化學修飾，不會出現預染蛋白Marker因為經過化學修飾后在SDS-PAGE電泳過程中遷移率發生改變，分子量信息不再準確的現象，也不會影響和膜的結合能力，肉眼就可以觀察轉膜效率。曝光的時候，需要集普通掃描儀（類似照相機）和ECL掃描儀或者熒光掃描儀為一體的設備，先通過普通掃描儀將色素蛋白Marker成像，然后利用ECL掃描儀或者熒光掃描儀將目標蛋白成像，再利用軟件將這兩種照片整合在一起，由于是同一張膜，拍照未挪動位置，只是進行二次不同捕光原理成像，就不存在拼接導致位置錯誤，并且照片是由專業軟件整合，不會出現修改和拼接痕跡。缺點是需要集普通掃描儀（類似照相機）和ECL掃描儀或者熒光掃描儀為一體的設備。
   方案二：利用熒光蛋白的顏色（帶顏色的熒光蛋白，例如藻紅蛋白、藻藍蛋白、別 藻藍蛋白、綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白和紅色熒光蛋白等，代替預染），肉眼就可以判斷轉膜效率。同色素蛋白一樣，由于蛋白沒有進行化學修飾，不會出現電泳遷移變化，蛋白分子量不準確的現象；也不會影響和膜的結合能力，能夠很好的提示轉膜情況。優點得到的熒光蛋白不需要進行預染處理就可以肉眼識別，也不需要進行改造去識別二抗，就可以熒光掃描。如果標記信號是熒光，僅僅使用熒光掃描儀就可以將Marker和目標蛋白顯示在同一張張片上；如果使用ECL發光液，按道理也能用熒光掃描儀就可以將Marker和目標蛋白顯示在同一張照片上，只是熒光蛋白需要激發后才可以產生熒光，而ECL發光屬于化學發光，是通過化學反應產生熒光。
    方案三：將熒光蛋白（帶顏色的熒光蛋白，例如藻紅蛋白、藻藍蛋白、別 藻藍蛋白、綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白和紅色熒光蛋白等，代替預染）與識別抗體IgG的proteinA、proteinG或 ProteinL，以及能被二抗結合的兔源或鼠源抗體Fc區基因融合表達，由于熒光蛋白自帶顏色，肉眼就可以判斷轉膜效率；同時，熒光蛋白 marker中的蛋白可以識別不同來源的一抗或二抗，能和目標蛋白一起曝光顯示在一張照片上，實現了熒光蛋白Marker既是自預染蛋白（自帶顏色）又是曝光蛋白。由于熒光蛋白Marker沒有進行化學修飾，確保了蛋白分子量準確，也不會影響電泳遷移變化和與膜的吸附能力。此外，在進行Western檢測時，不需要加入額外抗體試劑，也不需要使用集成多種檢測器的特殊設備，實驗室常規WB檢測設備就可以勝任。
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